1. Aktives Zentrum eines Enzyms am Beispiel von Pepsin

Der folgende Inhalt basiert auf einer Webseite zu einem Weiterbildungskurs für Mittelschullehrer am biochemischen Institut der Universität Zürich (© A. Honegger). Die auf Java basierenden Jmol-Applets wurden durch Videos und Abbildungen ersetzt. Inhaltlich wurden nur wenige Aspekte ergänzt/präzisiert.

1.1 Pepsin – Beispiel einer sauren Protease

Pepsin ist eine Endopeptidase, die zur Gruppe der Aspartat-Proteasen gehört, da das katalytische Zentrum durch zwei Aspartat-Reste gebildet wird. Mit einem pH-Optimum von ~2 ist diese Peptidase optimal auf die Funktion im sauren Milieu des Magens ausgerichtet. Pepsin spaltet beiderseits von Tyr- und Phe-Resten, langsamer auch saure Aminosäuren und Leucin. Neben Pepsin A gibt es noch das nahe verwandte Pepsin C (Gastricin), das ein pH-Optimum von ~3 und eine etwas engere Substratspezifität zeigt.

1.2 Kalottenmodell von Pepsin

Die Atome sind nach Atomsorten eingefärbt: C = grau, O = rot, N = blau, S = gelb.

Pepsin besteht aus 327 Aminosäuren in einer Kette.

1.3 Hydrophobizität von Pepsin

Unpolare, aromatische Aminosäuren (orange): Trp, Phe, Tyr

Unpolare, aliphatische Aminosäuren (gelb): Leu, Ile, Val, Pro, Met, Cys, Ala

Polare Aminosäuren (hellgrün): Ser, Thr, Asn, Gln, (Gly)

Geladene Aminosäuren (blau): Asp, Glu, Arg, Lys, His

1.4 Ladungen von Pepsin bei pH 7

Negativ geladene Reste (rot): Asp, Glu

Positiv geladene Reste (blau): Lys, Arg, His

(Was fällt auf? Wie sähe die Ladungsverteilung im Magen, bei ca. pH 2 aus?)

1.5 Sekundärstruktur von Pepsin

Pepsin enthält hauptsächlich beta-Faltblätter (gelbe Pfeile), aber auch einige kurze alpha-Helices (rote Spiralen) und Beta-Turns (blau). Alle anderen Bereiche stellen die Reste des Proteins (hellgrün) dar.

1.6 Disulfidbrücken von Pepsin

Disulfidbrücken (gelb) zwischen Cysteinresten stabilisieren das Molekül.

1.7 Katalytisches Zentrum von Pepsin

Das aktive Zentrum des Enzyms befindet sich am Grund einer tiefen Spalte, die das Molekül durchzieht. Die katalytischen Aspartat-Reste sind rot (Asp 32) und orange (Asp 215) markiert.

Im Kalottenmodell (vgl. folgendes Video) wird sichtbar, wie eng die Spalte ist, in die das Substrat binden muss. Es verwundert daher nicht, dass denaturierte Proteine deutlich leichter gespalten werden als native Substrate, die mit ihrer kompakten Faltung nicht zur aktiven Stelle gelangen können.

1.8 Mechanismus der Substratspaltung bei Aspartat-Proteasen (Pepsin)

Um die Vorgänge am aktiven Zentrum auf molekularer Ebene zu verstehen, wird am besten der Slider (Playhead) mit der Maus bedient, so dass das Geschehen Schritt um Schritt studiert werden kann.

einklappen

2. Blockierung des aktiven Zentrums eines Enzmys am Bsp. HIV-Protease

Der folgende Inhalt basiert auf einer Webseite zu einem Weiterbildungskurs für Mittelschullehrer am biochemischen Institut der Universität Zürich (© A. Honegger). Die auf Java basierenden Jmol-Applets wurden durch Videos und Abbildungen ersetzt. Inhaltlich wurden nur wenige Aspekte ergänzt/präzisiert.

2.1 Aktives Zentrum der HIV-Protease

Ein berühmtes Beispiel für eine Aspartat-Protease ist die HIV-Protease, deren Bauplan HI-Viren besitzen. Die viralen Proteine werden von den befallenen Zellen als ein grosses Polyprotein synthetisiert, das dann durch die virale Protease in die viralen Proteine zerlegt wird. Diese Proteine werden zum Bau neuer Viren benötigt.

Während Pepsin aus einer einzigen Peptidkette besteht, deren zwei katalytische Aspartat-Reste durch die unterschiedliche Umgebung unterschiedliche Ladungsverhältnisse (pK-Werte) aufweisen, besteht die HIV-Protease aus zwei identischen Peptidketten (pastellgrün und lila), die je ihr Asp 25 (gelb markiert) und im Stäbchenmodell im obigen Video) zur aktiven Stelle beitragen.

2.2 Blockierung des aktiven Zentrums durch Inhibitor

Inhibitoren der HIV-Protease (wie der Inhibitor ARQ, zuerst gelb markiert, dann im Kalottenmodell) hemmen die Vermehrung des Virus, da sie durch Blockierung des aktiven Zentrums das Schneiden des Polyproteins in die funktionellen Proteine inhibieren. Daher sind solche Hemmstoffe als AIDS-Medikamente interessant.

2.3 Darstellung der blockierten Enzymtasche

Im Video wird der Inhibitor (in Kalottendarstellung) zuerst orange markiert. Anschliessend wird auch das Enzym im Kalottenmodell dargestellt, wobei alle Atome türkis markiert werden. Nun ist ersichtlich, in welcher Vertiefung/Spalte (Enzymtasche) der Inhibitor ARQ (orange) anstelle des Substrats gebunden hat.

einklappen

3. Bindungsverhältnisse zwischen Inhibitor (Vanadat) und aktivem Zentrum eines Enzyms (Phosphatase)

Der folgende Inhalt basiert auf einer Webseite zu einem Weiterbildungskurs für Mittelschullehrer am biochemischen Institut der Universität Zürich (© A. Honegger). Die auf Java basierenden Jmol-Applets wurden durch Videos und Abbildungen ersetzt. Inhaltlich wurden nur wenige Aspekte ergänzt/präzisiert.

3.1 Struktur der sauren Phosphatase aus der Prostata

Saure Phosphatasen können in saurem Milieu Phosphatgruppen von organischem Molekülen abspalten. Im Folgenden betrachten wir die saure Phosphatase (1RPT) aus der Ratte, mit dem Inhibitor Vanadat (VO₄^3–), welcher – in Bezug auf Struktur und Ladung – eine grosse Ähnlichkeit zur Phosphat-Gruppe zeigt.

Das Video zeigt zuerst das Enzym in der Kalottendarstellung, dann in Cartoondarstellung die Sekundärstruktur und schliesslich die Quartärstruktur. Anschliessend wird das Peptidrückgrat (lila) nur noch in Stäbchendarstellung gezeigt, während die Nicht-Protein-Anteile im Kalottenmodell, dargestellt sind: der Inhibitor Vanadat (VO₄^3–) und 2 Kohlenhydratgruppen (bestehend aus NAG = N-Acetylglucosamin, BMA = Beta-D-Mannose).

3.2 Bindungsverhältnisse zw. Inhibitor (VO₄^3–) und aktivem Zentrum

Histidin 12 dient also im deprotonierten Zustand als Nukleophil, das im natürlichen Substrat das Phosphor-Atom angreift, während der protonierte Asparaginsäure-Rest als generische Säure ein Proton zur Verfügung stellt.

3.3 3-D-Struktur des katalytisches Zentrums der sauren Phosphatase

Können Sie im obigen Video die in der schematische Abbildung rechts dargestellten Aminosäuren-Seitenketten des katalytischen Zentrums identifizieren?

einklappen

4. Coenzym-Funktion am Beispiel NAD / Malatdehydrogenase

4.1 Die Malatdehydrogenase benötigt das Coenzym NAD

Das Enzym Malatdehydrogenase (MDH) ist ein Enzym im sogenannten Zitronensäurezyklus, einem zentralen Bereich der Zellatmung. Es katalysiert – unter Mithilfe des Coenzyms NAD – die Reaktion von Malat (Substrat) zu Oxalacetat (vgl. Leitprogramm, S. 55, Reaktionsgleichung ganz unten).

4.2 Funktion des Coenzyms NAD

Das Video zeigt, was das Coenzym NAD⁺ mit den 2 Wasserstoffteilchen macht, welche das Enzym Malatdehydrogenase vom Substrat Malat abgespalten hat. Das eine Teilchen geht als H⁺ in Lösung, das andere Teilchen wird formal als Hydrid-Ion (H^–) vom Coenzym gebunden.

Versuchen Sie zu verstehen, welche Bindungen sich lösen und welche sich neu bilden (das Video läuft zu diesem Zweck im Loop-Modus).

Die Antwort findet sich hier.

4.3 Dreidimensionalität der Wechselwirkung zwischen dem Enzym Malatdehydrogenase und dem Coenzym NAD

Damit das Coenzym NAD⁺ Wasserstoffteilchen bzw. Elektronen vom Substrat Malat aufnehmen kann, muss es sich in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums des Enyms Malatdehydrogenase befinden. Machen Sie diesen Sachverhalt mithilfe der JSmol-Animation auf dieser Webseite (PDB) sichtbar, d.h., lösen Sie die Aufgabe 4b.

einklappen

5. Konformationsänderung der Triacylglycerin-Lipase an der Lipid/Wasser-Grenzschicht

Der folgende Inhalt basiert auf einer Webseite zu einem Weiterbildungskurs für Mittelschullehrer am biochemischen Institut der Universität Zürich (© A. Honegger). Die auf Java basierenden Jmol-Applets wurden durch Videos und Abbildungen ersetzt. Inhaltlich wurden nur wenige Aspekte ergänzt/präzisiert.

5.1 Enzym-Substrat-Komplex

Lipasen spalten Fette (Lipide) in ihre Bestandteile (Fettsäuren). Dies geschieht zum Beispiel in der Leber oder im Magen.

In wässriger Lösung wird der Zugang zur Aminosäure Serin im katalytischen Zentrum durch eine Helix blockiert. Bindet die Lipase an die Grenzschicht zwischen Lipidphase und Wasser, verschiebt sich die Helix, und das Substrat kann an das aktive Zentrum der Lipase binden. In der obigen Abbildung hat das Substrat gebunden, womit die offene Form (Konformation) zu sehen ist.

5.2 Vergleich der Konformation des freien Enzyms mit jener des gebundenen Enzyms

Die Abbildung zeigt, dass sich die Konformation des freien Enzyms (blaue Kette) von der Konformation des Enzym-Substrat-Komplexes (grüne Kette) unterscheidet. Dies betrifft v.a den helikalen Bereich im Vordergrund (links unten) – dort sind die Ketten nicht deckungsgleich.

5.3 Konformationsänderung der Triacylglycerin-Lipase in Animation

Das Video zeigt den Wechsel zwischen der offenen Konformation (Substrat gebunden, d.h. in Lipid-Umgebung) und der geschlossenen Konformation (wässriges Milieu). Zuerst ist die Konformationsänderung im Kalottenmodell zu sehen, dann im Stäbchenmodell, wobei zuerst nur das Rückgrat, dann auch die Seitengruppen dargestellt werden. In der letzten Darstellung sind auch gut die 3 Aminosäuren (Serin, Histidin und Asparaginsäure) zu sehen, die als katalytische Triade das aktive Zentrum bilden.

Konformationsänderungen bei Enzymen sind auch möglich bei allosterischer Aktivierung oder Hemmung, aber auch bei der Bindung des Substrats (Induced-Fit-Modell, vgl. nächste Aufgabe).

einklappen

6. Induced-Fit-Modell am Beispiel der Hexokinase

6.1 Induced-Fit-Modell vs. Schlüssel-Schloss-Modell

Die Hexokinase ist ein wichtiges Enzym der Glykolyse, welche den ersten Bereich der Zellatmung darstellt. Sie katalysiert unter ATP-Verbrauch die Reaktion von Glucose (Substrat) zu Glucose-6-Phosphat.

Es gibt grundsätzlich zwei Möglichkeiten der Interaktion von Enzym und Substrat: das klassische Schlüssel-Schloss-Prinzip und das Induced-Fit-Modell. Das Schlüssel-Schloss-Prinzip stellt zwar die Spezifität eines Enzyms anschaulich dar, allerdings haben Untersuchungen gezeigt, dass die Vorgänge bei der Bindung von Enzym und Substrat zum Enzym-Substrat-Komplex dynamisch sind und durch das Induced-Fit-Modell besser beschrieben werden. So folgt die Bindung der Glucose an die Hexokinase dem Induced-Fit-Prinzip. Die folgenden zwei Videos stellen das Induced-Fit-Modell dem Schlüssel-Schloss-Modell gegenüber:

6.2 Konformationsänderung bei der Hexokinase

Sehen sie sich die Domänenbewegung des Enzyms (Scherbewegung) bei Bindung des Substrats in folgendem Video an (YouTube):

Zu den Aufgaben 1–6 liegt eine Musterlösung vor.

einklappen